RT-PCR怎么都没法克隆出目的片段

来源：学生作业帮编辑：搜搜做题作业网作业帮分类：综合作业时间：2024/06/16 22:03:27

RT-PCR怎么都没法克隆出目的片段
我用的上下游引物tm值相差较大,解决办法是先用低的退火温度跑5个循环,然后再用高退火温度的跑25个循环.试剂盒使用的是takara 一步法RT-PCR KIT请问各位针对这种情况有什么相应的解决办法?或者是经验?请与在下分享一下

博凌科为-为你你这样解决不了问题.像你现在使用的 2 step PCR不是用来解决上下游引物退火温度不一致的,而是用来解决引物不完全配对的情况的,比如克隆基因使用的引物因为和存在游离的内切酶位点,所以不能完全和cDNA模板配对,才在反应的前5个循环使用较低的退火温度.待到和引物完全互补的模板增加到一定量量后使用高退火温度.所以你的方法根本就用错了.你这样的情况建议你试用梯度温度,从高退火温度降低到低退火温度慢慢找吧.理论上讲,两个引物的退火温度不一致,应该是使用低退火温度才对,虽然这样会降低引物的特异性.其实,最直接的解决办法,还是你直接设计新的引物把.设计个引物可能比你浪费掉的那些试剂要便宜.

RT-PCR怎么都没法克隆出目的片段从克隆载体上PCR出目的基因原理 RT-PCR出一段目的基因,为什么要把它先TA克隆呢?为什么不能直接把它连接到相应的质粒上呢我的目的片段连T载体后,挑单克隆摇菌,用菌液PCR能P出目的片段,再提质粒用Ecor1做酶切,片段变小怎么回能不能用PCR直接扩增目的片段,然后转入表达载体,代替在克隆载体或dh5a中的扩增大家好,问一个不能等到台面上的问题：目的基因片段是扩增片段吗?什么是RT-PCR的目的基因片段,谢谢做RT-PCR的目的是什么? PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别? 请问做RT-PCR时,怎么根据扩增的片段长度确定dNTP的用量? PCR产物引物二聚体严重,目的片段很淡,怎么解决啊? PCR扩增出目的片段之后为什么要酶切?酶切下来的是目的片段和载体?然后再把它们连起来?很困惑. 为什么我的目的基因连接克隆载体转化、提质粒后,酶切鉴定正确,而质粒PCR和菌液PCR鉴定都不正确呢?着急