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T 载体与 目的基因连接成功,测序结果也正确.从新摇菌,提取质粒,在进行双酶切,一直切不下来.

来源：学生作业帮 编辑：搜搜做题作业网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/05/10 12:25:41
T 载体与 目的基因连接成功,测序结果也正确.从新摇菌,提取质粒,在进行双酶切,一直切不下来.
用的是 ClaⅠ ,EcoR Ⅰ 两种酶 体系20
酶切 3小时 过夜 都试过了
期待解决
T 载体与 目的基因连接成功,测序结果也正确.从新摇菌,提取质粒,在进行双酶切,一直切不下来.
解决办法：1、cla1是一个比较不常见的酶,可能酶切体系和ECOR1的缓冲体系不一样,试着分别酶切,就是先切cla1,然后纯化后切ECOR1；或者查找哪个酶的酶切效率高些,那个后切；2、3个小时可能太短了,我一般都是5个小时,或者过夜；3、可能是你菌挑错了,或污染了,重新调菌或者把原来构建成功的质粒进行转化,再酶切.
再问： 我试过单酶切，先用的是cla1 切3个小时 65摄氏度 13分钟 然后再用ECOR1切 3个小时，但是也没有结果啊。 菌估计是不能挑错的 我做的是蓝白斑筛选，挑的单菌落 进行摇菌，提取质粒 拿去一定体积的去测序，剩下的一部分进行酶切。。。。测序的结果显示和GNEBANK上的一样并有我的酶的序列。
再答： 我建议还是把你切的质粒用别的酶验证一下，这样更能确定是不是你要的那个片段，比如T载体上的多克隆位点和目的基因上的位点一起切，再确定。先把握是不是你的东西。如果确定是的话，我建议过夜切。另外你可以查一下这个cla1的特性。再一个为什么挑这么一个不常见的酶用呢？如果不是实在没办法不建议用不常见的酶。 另外，你的质粒有可能过多或过少，你通过什么判断切不下来？
T 载体与 目的基因连接成功,测序结果也正确.从新摇菌,提取质粒,在进行双酶切,一直切不下来. 目的基因导入受体细胞是怎样进行的?如何防止目的基因与质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接?请 为什么我的目的基因连接克隆载体转化、提质粒后,酶切鉴定正确,而质粒PCR和菌液PCR鉴定都不正确呢?着急 用同种限制酶切质粒和目的基因DNA,连接后,产生的载体-载体连接物不是也有标记基因而且在培养基上生长吗 为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接,酶切的图示 质粒与目的基因连接得到几种重组质粒 目的基因片段与载体质粒的选择? 如何使目的基因连接到质粒载体上,目的基因怎么获得呢? 目的基因与质粒反向连接为什么就不能正确表达 在构建基因表达载体时候,怎么利用选择培养基鉴别是质粒—质粒,目的基因—目的基因,还是质粒—目的基因 用同种限制酶切质粒和含有目的基因的DNA,用DNA连接酶连接后为什么不会出现载体-目的基因连接物这种产物? 目的基因与载体的体外连接.为什么目的基因要比载体多些?